A periodontite bovina é uma doença multifatorial primariamente associada a uma microbiota potencialmente patogênica alojada no biofilme oral dos animais. Os biofilmes são estruturas organizadas, nas quais os constituintes coexistem em simbiose, já descritos como fator predisponente à periodontite em outras espécies. O objetivo do presente estudo foi caracterizar a estrutura e os aspectos químicos do biofilme supragengival pigmentado de preto em bovinos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS), respectivamente, e determinar sua relação com a periodontite bovina. Onze dentes pré-molares de diferentes animais foram avaliados; cinco amostras não pigmentadas e seis amostras com biofilmes pigmentados de preto foram inicialmente submetidas à MEV, e três áreas dessas amostras foram selecionadas para EDS. A estrutura do biofilme pigmentado foi mais complexa e irregular devido a um maior teor de elementos minerais. Os dados semi-quantitativos de EDS indicaram uma associação de ferro (p<0,014) e magnésio (p<0,001) com a ocorrência de periodontite, enquanto carbono, fósforo, cálcio, manganês, sódio e potássio não foram associados à doença. Carbono (p<0,039), manganês (p<0,007) e ferro (p<0,015) foram associados à pigmentação, enquanto fósforo, cálcio e magnésio não foram associados a ela. O teste de correlação de Spearman mostrou as relações entre cálcio e fósforo, e ferro e silício. A forte associação de ferro no biofilme supragengival pigmentado e com a ocorrência de periodontite sugere a presença de microrganismos que utilizam esse elemento em seu metabolismo e que também estão associados à periodontite bovina. Este estudo sugere que os depósitos pigmentados na coroa dos dentes de gado são um verdadeiro biofilme com a deposição de ferro, e indica que a presença de ferro e magnésio nessas formações pode estar envolvida no metabolismo de alguns microrganismos associados à etiologia da periodontite bovina.
Biofilmes dentais são estruturas dinâmicas e complexas que se formam no esmalte dental através da colonização organizada de múltiplas espécies microbianas do ambiente bucal (Kolenbrander et al., 2002). Esses biofilmes podem ser classificados como subgengivais, quando formados no sulco gengival ou bolsa periodontal, ou supragengivais, quando formados na coroa clínica dos dentes (Kolenbrander et al., 2010). Além de atuar na manutenção da saúde bucal, algumas espécies bacterianas presentes nos biofilmes desempenham um papel importante na etiologia das doenças periodontais em humanos (Hojo et al., 2009; Akcali & Lang, 2017) e animais (Elliott et al., 2005; Rober et al., 2008; Gaetti-Jardim Junior et al., 2012; Borsanelli et al., 2016; Agostinho, 2017; Campello, 2017).
A periodontite é uma infecção multifatorial associada a complexos bacterianos peculiares, capazes de interagir com os tecidos e células hospedeiras resultando na liberação de citocinas, quimiocinas e mediadores inflamatórios responsáveis pela destruição das estruturas periodontais (Holt & Ebersole, 2005; Hajishengallis, 2015). Esses grupos microbianos são anfibióticos, estabelecendo diferentes tipos de relações ecológicas (Marsh et al., 2011), e ocupando nichos ecológicos no sulco gengival saudável e bolsas periodontais (Bosshardt, 2018). A interação entre esses grupos microbianos específicos, especialmente bacilos anaeróbios Gram-negativos, e as condições ambientais ainda é pouco compreendida, uma vez que a periodontite bovina é mais prevalente em animais que permanecem em áreas recém-formadas ou passaram pelo processo de reforma de pastagens (Dutra et al., 1986; Dutra & Döbereiner, 2001). Em lesões periodontais de bezerros, a média percentual de bactérias negras pigmentadas é consideravelmente maior quando comparada à dos mesmos animais após serem transferidos para áreas de indene e apresentarem remissão dos sintomas clínicos de periodontite (Dutra et al., 2000). A doença não ocorre sem os microrganismos comuns constituintes da microbiota, que são encontrados principalmente no biofilme oral desses animais.
Pseudomonas, Burkholderia e Actinobactérias são os táxons mais prevalentes no microbioma subgengival de bovinos saudáveis, enquanto Porphyromonas, Prevotella e Fusobacterium são mais frequentes em animais com periodontite (Borsanelli et al., 2018). A diversidade do biofilme microbiano aumenta com a periodontite, mas os fatores que levam às alterações teciduais e as possíveis características bioquímicas estruturais do biofilme oral em animais com diferentes condições periodontais não são claros.
O processo de acumulação e mineralização do biofilme dental resulta na formação de cálculo dental. Em ruminantes, esse cálculo é geralmente visualizado como uma acumulação com pigmentação marrom a preta fortemente aderida à superfície dental. Em vacas, foi descrito como cobrindo extensões variadas dos dentes mastigatórios. No entanto, na época, pouco se sabia sobre o papel desempenhado pelo cálculo dental no estabelecimento e progressão da periodontite (Ingham, 2001). Em pequenos ruminantes, o cálculo supragengival pigmentado de preto foi descrito como um achado comum e associado à ocorrência de recessão gengival (Agostinho, 2017; Campello, 2017).
Em humanos, os principais componentes do cálculo dental são cálcio, magnésio, flúor e dióxido de carbono (Gron et al., 1967; Fialová et al., 2017), que podem estar associados a compostos ambientais, dieta e hábitos (Fialová et al., 2017). Em bovinos, as propriedades físicas do esmalte dental foram bem caracterizadas; os principais constituintes dos cristais de hidroxiapatita, oxigênio, cálcio e fósforo, aparecem em concentrações altas (Nogueira et al., 2014). No entanto, os estudos sobre a estrutura e composição química do biofilme supragengival em bovinos e sua correlação com a periodontite são bastante limitados.
Compreender a ecologia do biofilme supragengival e sua relação com a periodontite é um passo importante para avançar no conhecimento sobre a etiologia, patogênese, controle e profilaxia dessa doença em bovinos. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a estrutura e os aspectos químicos do biofilme supragengival pigmentado de preto usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS), respectivamente, e entender sua possível relação com a periodontite bovina.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta de amostras. Onze dentes molares superiores de diferentes bovinos, cinco sem pigmentação visível e seis com um biofilme preto pigmentado visivelmente, foram coletados. Essas amostras foram coletadas de animais com idade média de 36 meses de um matadouro na região de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Dados como sexo, local de origem, dieta, alterações dentais e idade aproximada de cada animal foram obtidos. A condição periodontal foi estabelecida após sondagem da margem gengival de cada dente. Animais com bolsa periodontal mais profunda que 5mm foram considerados como apresentando periodontite. Para a extração dental, a área entre o terceiro pré-molar e o segundo molar foi isolada e a mucosa gengival do primeiro molar foi removida com um elevador periosteal de Molt. Os dentes foram extraídos do osso alveolar usando um cinzel simples e um martelo Mead. A coleta de amostras foi realizada até 30 minutos após o abate para preservar a estrutura do biofilme formado na superfície bucal do primeiro molar superior.
Preparação das amostras. Após a extração, cada raiz dental foi seccionada; as coroas clínicas das amostras tinham uma largura máxima de 12mm e uma altura e comprimento de menos de 30mm. Em seguida, os detritos de matéria orgânica foram removidos de cada amostra. As amostras foram lavadas duas vezes com 300μL de solução fisiológica (NaCl 0,9%), e então, o biofilme da coroa foi fixado com 1ml de glutaraldeído a 2% por 30 minutos à temperatura ambiente. O biofilme foi então desidratado em banhos sequenciais de etanol (1mL) em concentrações de 50%, 70%, 90% e 100% por 10 minutos em cada concentração. Após a desidratação e secagem, as amostras foram armazenadas em um recipiente com sílica para controle de umidade (modificado de Santana et al., 2013).
Caracterização estrutural por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise da composição mineral por espectroscopia de energia dispersiva (EDS). Para a análise semi-quantitativa da composição mineral do biofilme bovino usando EDS, os primeiros molares foram fixados com fita dupla-face de carbono, montados em uma base de resina acrílica incolor e receberam uma cobertura de carbono (Denton Vaccum Desk II). Imagens dos biofilmes com e sem pigmentação na região cervical da face vestibular dos primeiros molares foram capturadas usando MEV JSM-5600 (Jeol, Tóquio, Japão) com ampliações de 100x e 3000x. Usando o ajuste dos parâmetros da Jeol (tamanho do ponto entre 28-32nm e tempo de morte ideal do PHA entre 20-25%) a uma magnificação de 3000x, as imagens de MEV foram transferidas para a microanálise EDS (Análise de Raios X por Energia Dispersiva; Vantage, Noran Instruments, Middleton/WI, EUA). Nas imagens capturadas com uma ampliação de 3000x, três áreas de 81μm² cada na superfície cervical das amostras foram selecionadas aleatoriamente para a análise semi-quantitativa; essas áreas foram bombardeadas com elétrons de alta energia permitindo a detecção de raios-X dispersos e a avaliação do perfil de absorção característico de cada elemento químico. Cada espectro de absorção foi capturado por 100 segundos a uma tensão de 15kV e uma distância de trabalho de 32mm. A média e o desvio padrão de cada mineral registrado foram calculados.
Análise estatística. Os valores semi-quantitativos dos elementos minerais foram correlacionados com a condição clínica (periodontite ou periodonto saudável) e com a presença de pigmentação usando o teste t de Student e o teste de Mann-Whitney. As possíveis associações entre os diferentes elementos compostos presentes nas amostras foram avaliadas usando o teste de correlação de Spearman. O nível de significância previsto foi p<0,05. Avaliações descritivas foram feitas com base nas imagens de MEV.
